Разрешение липидов в живых клетках: новый прорыв в гиперспектральной фотоакустической микроскопии среднего инфракрасного излучения

Липиды являются не только структурными компонентами клеточных мембран и молекул хранения энергии, но они также тесно связаны с возникновением и развитием рака, ожирения, диабета,сердечно-сосудистые заболеванияОднако непосредственное наблюдение и различие различных типов липидов в живых клетках уже давно сталкивается с техническими проблемами.Традиционные методы флуоресцентной маркировки ограничены эффективностью маркировки, специфичность и потенциальное вмешательство в клеточные функции, в то время как оптические методы без ярлыков часто с трудом различают молекулы липидов с аналогичными химическими структурами.

Nature Methods опубликовала исследование, в котором представлена технология под названием "Гиперспектральная фотоакустическая микроскопия области отпечатков пальцев" (hyFOPM).Используя односоединение вибрации режимы в средней инфракрасной области отпечатков пальцев, эта технология позволяет обнаруживать без маркировки и динамическое изображение сфингомиелина (SM) и холестерина (Chol) в живых клетках.

Технические принципы
Большинство оптических методов без ярлыков полагаются на сигналы в области вибрации растяжения C-H (примерно 2800 ≈ 3000 см−1), но спектральные полосы в этой области очень похожи на различные липиды,что затрудняет различие между различными типамиВ отличие от этого, область среднего инфракрасного отпечатка пальцев (9001730 см-1) содержит больше информации о вибрации с одной связью, отражающей уникальную структуру молекул.такие как характерное поглощение амидных связей, эфирные связи и стероидные кольца.

Дизайн системы hyFOPM основан на этой концепции. Он использует настроенный квантовый каскадный лазер в качестве источника возбуждения, охватывающий диапазон 900 ≈ 2932 см−1 со спектральным разрешением 2 см−1.Лазерные импульсы возбуждают образец для генерации фотоакустических сигналовСистема имеет пространственное разрешение около 4,3 мкм, что позволяет получать изображения на уровне живых клеток.

Валидация липидных моделей
Для проверки целесообразности технологии исследовательская группа сначала подготовила двумерные модели липидного раствора, содержащего холестерин (Chol), ненасыщенный фосфатидилхолин (DOPC),и сфингомиелин (SM).

(1)Сравнение спектральных характеристик

Спектры области отпечатков пальцев, собранные с помощью гиФОПМ, очень соответствуют результатам ATR-FTIR.холестерин имеет сильный пик поглощения при деформации стероидного кольца при 1056 см−1; DOPC характеризуется C=O растяжной вибрацией эфирной группы при 1731 см−1; а сфингомиелин соответствует амидной I полосе, амидной II полосе и вибрации изгиба жирной кислоты CH2 при 1645 см−1,1555 см−1, и 1464 см−1, соответственно.

(2) Способность к спектральному размешанию и классификации
При использовании только 15 номеров волн в области отпечатков пальцев для линейного размешивания перекрестная связь между холестерином и сфингомиелином близка к 0%, в то время как перекрестная связь для DOPC составляет 23%.перекрестная связь значительно увеличивается при использовании 7 номеров волн в области растяжения C-HДальнейшее применение линейного дискриминантного анализа (LDA) показывает, что средняя точность классификации достигает 96% при использовании области отпечатков пальцев или области C-H,и достигает 97% при использовании всех номеров волн.

(3) Модели гигантского одноклеточного пузыря (GUV)
Исследование подготовило три типа GUV для моделирования клеточных мембран: модель 1, смесь SM и Chol 1:1, образующая плотную упорядоченную мембрану; модель 2, 2:21 смесь DOPC, SM и Chol, сосуществующая в жидко-упорядоченной и жидко-неупорядоченной фазах; и модель 3, чистая DOPC, образующая неупорядоченную жидкую мембрану.Изображения, полученные с помощью hyFOPM при 2852 см−1, морфологически соответствуют тем, которые получены с помощью флуоресцентного окрашивания красного Нила.Спектральные характеристики различных пузырей соответствуют чистым липидам, подтверждая, что отдельные компоненты в смешанных мембранах могут быть идентифицированы.

(4) Приложения контроля качества
Проведение спектральных измерений на 10 различных GUV для каждого типа и составление трехфазных диаграмм,Исследовательская группа обнаружила, что фактический липидный состав отклонялся от целевого соотношения (расхождение примерно 40%)Это указывает на то, что для оценки качества при подготовке GUV можно использовать hyFOPM.

Применение в живых клетках
Исследование далее применяло гиФОПМ к живым клеткам, наблюдая динамические изменения сфингомиелина и холестерина в двух клеточных моделях соответственно.

(1) Набор сфингомиелина в клетках А549
Клетки аденокарциномы легких человека (A549) лечили противоопухолевой соединением 2- гидроксиолевой кислоты (2- OHOA), который, как ожидается, индуцирует накопление сфингомиелина.Спектры области отпечатков пальцев (1600 ≈ 1400 см−1) были собраны из 50 клеток., показывающее, что пиковая площадь 1464 см-1 увеличилась на 117% после лечения, по сравнению с только 23% в контрольной группе за тот же период.Изображение было выполнено на 3000 клетках с использованием только четырех номеров волн (2852 см−1 для общего количества липидов).Результаты показали, что сигнал сфингомиелина продолжал повышаться через 48 и 72 часа после лечения.в то время как сигнал холестерина не показывал значительных изменений.

(2) Загрузка холестерина в HEK-клетках
Человеческие эмбриональные клетки почек (HEK293) были соинкубированы с комплексом метил- β- циклодекстрин- холестерин (MβCD- Chol) для повышения уровня холестерина в клеточной мембране.Спектры области отпечатков пальцев из 50 клеток показали, что пиковая площадь 1048 см-1 увеличилась на 161% после лечения., в то время как пик 1464 см-1 для сфингомиелина незначительно снизился в соответствии с известным свойством циклодекстрина экстрагировать некоторые липиды мембраны при доставке холестерина.Многоволновое изображение 3000 клеток подтвердило повышение уровня холестерина, с небольшим увеличением общего липидного сигнала и незначительным изменением белкового сигнала.

Значение и перспективы
Это исследование демонстрирует способность различать липидные молекулы с похожими химическими структурами в живых клетках без маркировки.По сравнению с традиционными методами, основанными на флуоресцентной или изотопической маркировке, hyFOPM избегает таких проблем, как эффективность маркировки и вмешательство в клеточные функции,и его селективность может быть гибко адаптирована к спектральным характеристикам целевых липидов путем регулирования количества волн возбуждения.

Спектральная специфичность нынешней системы в области отпечатков пальцев превосходит спектр C-H, что открывает возможности для различения большего количества липидных подтипов.Исследование также указывает на то, что сочетание передовых спектральных методов размешиванияКроме того, фотоакустическая микроскопия среднего инфракрасного диапазона может достигать глубины изображения более 150 мкм в тканях.и будущие применения могут быть расширены до толстых образцов или в условиях in vivo. технологическое ускорение (например,спектральное выборка) и миниатюризация системы являются важными направлениями для продвижения этой технологии в направлении анализа пункта обслуживания или рутинных лабораторных испытаний.